主水ら同心による犯罪の取り締まりが強化される中、「裏の仕事をばらす」といった脅迫状が主水に届いた。だが、つきとめてみるとその手紙の差出人は、取り締まりのおかげで親を捕らえられた子供たちだった。彼らの背後には“世直し”を旗印とする侍がいた。主水は彼らに脅され、奉行所の公金を奪う謀略の渦中に巻き込まれる。
江戸に近い温泉宿の主人・藤七とその女房お甲は宿に来た若い娘に麻薬を飲ませ、本業である盗みの手下として使っていた。藤七らは同心にも金を握らせ、荒稼ぎしていた。大だなの一人娘お弓が彼らに捕まり、それを知った父・弥平ともども惨殺された。加代らは弥平が残した仕事料をもとに行動開始。
からくり細工師・孫七が加代に商売を持ちかけた。孫七は自分の細工物を解体できたら賞金として千両をやるという。加代は話にのり、その細工物を売りに回った。孫七はかつて上方で抜け荷を働き、千両を盗んで姿を消していた。孫七は生き別れになった娘を捜すため、身を隠してその娘の手がかりを求めていた
筆頭同心・田中が占い師・白雲を招いて同心たちに講演。が、どうもインチキくさい。主水は加代に白雲の身辺を探るように命じる。白雲は、金銭出納役・下山と関係のあった女・お直らと下山をゆすっていたのだ。しかも、奉行所の公金２百両を貸せと迫っていた。
生け花の師匠お京は政の育ての親。お京は愛人の鬼平次らと組み、仕事人として裏の稼ぎをしている。お京らが旗本一行を殺したとき、鬼平次が重傷を負った。鬼平次の口から組織が暴かれることを恐れ、お京は同心の瀬川に鬼平次の家を教えた。竜の調べで、政の父親もかつてお京に売られたことがわかる。
筆頭同心の田中が江戸中の仕事人を捕らえるよう同心たちに命じた。加代たちは、ひとまず山あいの温泉宿に身を隠すことにする。吹雪の夜、その宿に江戸を追われた儀衛門ら３人の仕事人が現れた。彼らを追い、田中や主水はこの宿に着くが、一味は加代らを人質に立てこもる。
札差近江屋は息子・小太郎を医師・源庵に弟子入りさせた。ある日、臓器移植の話を聞いてきた源庵が、移植実験をしたいと言い出した。息子のためになるならと、近江屋は生体実験用の人間を調達することを引き受けた。白羽の矢が立てられたのは大工の留吉。竜もよく知る男だった。
かつての仕事人仲間石亀を加代が見かけた。石亀は相棒を殺されたショックで仕事料20両を持ったまま姿を消していた。加代が金を返せと言うと石亀の女房お絹が働いて返すという。以前芸者だったお絹は近くの料亭で働きだした。そしてたちまち売れっ子。土地の親分２人がそのお絹の奪い合いで対立する。
卵売り梅太郎らの夢は仕事人になること。主水の注意も聞かず加代の前で殺し技を披露する。そんな梅太郎らに旗本寄合の上林が目をつけた。上林らは両替商からワイロをとっていたが、それを目付・三谷に知られていた。上林は梅太郎らを使って三谷を殺そうとする。
老舗のひも問屋大和屋に竜が気に入られ、一人娘お袖の婿にと望まれる。だが、仕事人が嫁を貰うわけにはいかない。一方、大和屋の失脚を狙う同業の森田屋は松尾藩の家老三野田と結託、折からのやくざ同士の抗争にみせかけて大和屋を殺した。お袖は父の恨みを晴らして、と竜に頼む。
かつての名仕事人亀吉は、今は老いぼれて見る影もない。その亀吉が、孫娘おはんの嫁入り資金を手に入れようと大仕事をもくろんでいた。始末する相手は、主水も入れぬ無法地帯「浮島」の支配者・海蛇。だれも本当の顔を知らない男だ。そんな折、おはんが海蛇一味に捕まり、引き取りに来いという矢文が亀吉に届く。
竜が何者かに命を狙われた。問い詰めた政は、竜が伊賀の抜け忍と初めて知った。抜け忍は捕らえられれば殺されるのがおきて。竜を狙うのは一族の長、九十九、菊丸たちだ。菊丸は竜の裏稼業にも気付いている様子。一味は奥多摩の村にひそみ、竜をはじめ、仕事人たちをおびき寄せる。
江戸の町に夜になるとヒヒが現れ、小町娘をさらっていく。昨夜も丁字屋のお小夜が主水の目の前でさらわれた。回船商大黒屋が火消しの伝次に猿のぬいぐるみを着せ、娘をさらわせていたのだ。大黒屋は、さらった娘を大名の雪州侯らに差しだし、取り入っていた。
典膳は鹿島新念流抜刀術の達人。その典膳と配下が自らの腕を試す、辻斬りを始めた。仕置きに立ち上がった主水だが、相手がすご腕だけに、うかつに手が出せない。順之助は、典膳の門弟・小沼や雪井たちの抜き打ち速度を調べ、対策を練る。やがて一味と対決する時がきた。
夫と死別した八重は、幼いゆきをかかえ、越後屋からの仕立ての仕事で細々と暮らしていた。ある日、越後屋は八重に愛人にならないかと持ちかけるが、拒否される。八重には南町与力・倉沢も執心していた。越後屋は仕事を差し止め、八重を窮地に追い込み、幼いゆきにも嫌がらせ。ゆきから話を聞いた政が越後屋へ乗り込む。
商家の一家心中が相次いだ。いずれも組みひもで首をつっていた。不審をもつ主水は仕事人から足を洗った荘右衛門から、組み紐を使って強盗を働いている昔の仲間仏之助一味の始末を頼まれる。主水が腹痛で動けぬ間に、一味は荘右衛門を惨殺。真相をつきとめた竜たち仕事人が動き始める。
勘助は幼い息子を連れて江戸へ来た。母の顔を知らずに育った息子のため、新しい母親を捜すのが目的。が、田舎者扱いされ女たちに見向きもされない。そんな勘助にお葉が近づいた。お葉は盗賊の一味で、呉服屋から千両箱を盗む仕事に勘助を利用するつもり。そのころ主水は続発する同心による犯罪の調べに追われていた。
政が昔なじみの音吉と出会った。様子のおかしい音吉の後をつけると、長屋で音吉の帰りを待っていたのは、かつての政の恋人・お涼だった。５年前、政とお涼は恋仲だったが、ある事件がきっかけで政は村を出た。今の音吉は土蔵破り辰蔵の一味。なんとか足を洗おうとしていたが…。
神童といわれる三味線弾き木阿弥が三味線棹屋流の家元佐理衛門と弾き比べをすることになった。その木阿弥が立花藩江戸家老小野寺らの鉄砲密造の相談を小耳にはさんだ。佐理衛門の妹お千代に惚れている木阿弥は、お千代との結婚資金ほしさに小野寺らをゆすった。が、毒殺され、お千代も危ない。竜が小野寺の悪事を知る。
政が野菜売りの正太と親しくなった。めし屋のおみちがばくち打ち風の弥平と祝言を挙げると聞き正太は心配していた。やくざの親分・松五郎の子分になりたい弥平は、松五郎におみちを抱かせる。だまされて松五郎に乱暴されたおみちは精神に異常を起こす。敵をとりたい正太も松五郎らに殺されてしまった。
回船商の用心棒・天堂を狙った竜が夜タカのちよ美を助けようとして仕事に失敗。足に傷を負った竜はちよ美の住む廃屋に隠れた。命を狙われた天堂は仕事人を捕らえて手柄にしないかと口入れ屋一文字屋に持ちかけた。竜のためになけなしの金で傷薬を買ったちよ美が、客をとっているところを一文字屋の手下に見つかり、捕らえられる。
源兵衛長屋の井戸の水が万病に効くと評判。大奥年寄・村岡と祈祷師の日恵は、長屋をつぶして寺を建て、その井戸水で大もうけしようと考えた。長屋の家主は生け花の師匠お千加。立ち退きを断られた村岡は、日恵らに深夜、長屋に放火させた。お千加はやけどが原因で死に、花を届けていた政が村岡らの悪事を知る。
大阪の同心田倉と跡部が小判鋳造用の金塊30個を江戸に運んだ。到着した時金塊が３個減っており、御金改の後藤は田倉に疑いを持った。田倉と跡部らは途中、荷造りの縄をゆるめて３個をわざと落としてきたのだ。田倉らは予定通り金塊を拾い集めたが、１個足りない。それを拾っていた加代は、金塊を庭に埋めて隠す。
島帰りの清次が主水らとは違う仕事人一味に襲われた。清次は政と一緒に仕事人の手ほどきを受けた男。見つけ次第殺せという回状が仕事人仲間に回っているらしい。７年前、清次はお品という女と将来を約束していた。そのお品は、今は与力・根岸の妻。清次は陥れられた自分に気付く。
源九郎一座の芝居が人気を呼んでいた。源九郎の息子・牛若は、一座 座頭・重兵衛らが仕立てた偽の息子で、牛若を座長にして甘い汁を吸おうとしていた。が、たくらみに乗らなくなった牛若に業を煮やした重兵衛は、源九郎殺しを企て、牛若と牛若の恋人・お静をも殺す。最後の力を振り絞ったお静は竜に仕事料を渡した。
辻斬りが出没し、罪もない人を次々と殺していた。奉行所では主水を屋台のおやじに化けさせるおとり作戦を考え出した。その夜、主水にきりつけてきた辻斬りは、将軍家の世継ぎ宗孝だった。なぜか主水の手助けをする梅富は宗孝の側近にきられる。主水らは最後になるかも知れぬ仕事をする決心を。
加代が、北町奉行神尾殺しを請け負った。神尾はやくざの親分紋兵衛と通じ、目こぼし料を稼いでいる男。主水は元締に助っ人の壱、弐、参を紹介され、神尾殺しを承知した。
加代が松倉藩江戸留守居役久永の息子恭四郎殺しを請け負ってきた。依頼主は何とその母親美濃だった。主水らは暗殺の機会をうかがう。
主水ら仕事人の今度の標的は大奥御年寄の阿茶局。将軍にとり入ろうとする彼女は、懐妊している奥女中を御庭番勘蔵に命じて殺させていた。
南町奉行所は、強力な仕事人狩り部隊・覆面組を結成。そんな中「ねずみ小僧の女房」と名乗る松平家の中老・お初が、二十八年前に殺された夫・次郎吉の恨みを晴らして欲しいと、元締・初瀬に依頼。しかし覆面組を警戒する主水は、この仕事を断るのだった。
大久保彦左衛門の直系の子孫・彦次郎は、変わり者だが老いてもなお世を憂う硬骨漢。ところが彦次郎に見込まれ中間になった魚屋の太助が、何者かに殺されてしまう。太助の女房・お滝は彦次郎を犯人だと決め付け、恨みを晴らして欲しいと仕事を依頼するが……。
米問屋・大黒屋の手代・弥之助は、主人の娘・お勢をかどわし、金を奪った罪で打ち首と決まった。だが弥之助が水戸光圀公の印籠を持っていたので、斬首は保留となる。これを知った大黒屋の後見人・仁兵衛は…。
江戸でも屈指の小間物問屋・長崎屋市兵衛の後妻・お藤は、店の宣伝代わりに八百屋お七が着ていたという振袖を着て外出していた。ところがある日、長崎屋の先妻の娘・お小夜が顔見知りの秀を突然訪ね、何も聞かずにその振袖を預かって欲しいと頼むのだった。
人気女形・瀬川菊之丞が、さるお屋敷の奥女中・梅枝と心中。その数ヵ月後、遊び人の清二が何者かに斬り殺される事件が発生。清二が秀の作った簪を握り締めていたことから、秀は覆面組にマークされることに。事態を重く見た元締・初瀬は、秀の始末を命じる。
覆面組がいよいよ秀に的を絞り、襲撃を開始。その巻き添えで、さだの娘・みよが犠牲となってしまう。さだは娘の恨みを晴らして欲しいと仕事を依頼し、初瀬と主水らは覆面組との全面対決を決意。しかしその会話を、初瀬に仕える女中・みねが盗み聞きしていた。
近頃江戸には無宿者が増え、主水はその取り締まりで大忙し。その頃朝右衛門に仕える中間・与之吉は、主人の名刀を密かに売り飛ばそうとして、朝右衛門に捕えられていた。彼は幼馴染のおきちを岡場所から身請けするため、五十両もの大金を必要としていたのだ。
材木問屋・出羽屋の主人・大八は元関脇で、町火消し・め組とは三十年前の大喧嘩以来の犬猿の仲。そんな中、愛娘・お妙の祝言を控えた大八が何者かに殺されてしまう。現場付近でめ組の纏持ち・金次の鳶口が発見され、金次は追われる身となってしまうが……。
近頃江戸では、五人組の押込強盗が大暴れ。そんな中お歌は、皆殺しにされた両替商・近江屋の中で唯一生き残った少年・新吉と知り合う。一方、研ぎ師の元で名刀「関の孫六」を見かけた朝右衛門は、多くの血を吸っているその刀が兄・垣内左近のものだと知る。
最近江戸では、腕の良い鍛冶屋が次々と行方不明になっているという。そんな中、お歌と知り合いの鍛冶職人・清六は、廻船問屋・倉田屋からご禁制の鉄砲作りを頼まれることに。清六は、病に伏せる女房・お千代の薬代を都合するためこの仕事を請けるのだが……。
ある晩主水の同僚同心・岡島が刺殺され、その側で血まみれの匕首を持っていた女が捕えられた。女は岡場所・桔梗屋の女郎・弥生で、以前秀と同じ町内に住んでいた気立ての良い娘。死んだ岡島は、どうやら最近大量に出回っている阿片を追っていたらしいが……。
近頃江戸では常楽寺の美少年祈祷師・浄円が評判となり、連日大盛況。そんな中、夢次が岡惚れしていた娘・お里が常楽寺へお参りに出たきり消息を絶ってしまう。一方主水も「娘が戻らない」という訴えを何件も受けて常楽寺を探るが、行方は杳として知れない。
よろず口入処・出雲屋は、結婚志望の独身男女を見合いさせる商売で大繁盛。出雲屋の主人・清十郎は女形上がりの美男で、かつては主水や秀も認める腕利きの仕事人であった。一方、袋物問屋の若旦那・佐吉は出雲屋に紹介された娘・お澄を一目で気に入るが……。
江戸市中では相場取引が大流行し、投機の過熱を憂慮した幕府は相場の売買を禁止することに。そんな中、船宿・たつみ屋の当主・吉兵衛は札差・阿波屋に預けていた大金を奪われ、挙句この一件を奉行所へ訴え出ようとしたために、自殺に見せかけて殺されてしまう。
五年前に遠島の刑に処された盗賊・かげろう組の手下・おちかとおきぬが、島抜けして江戸に潜伏。二人は、処刑されたはずの頭が替え玉を使って生き延びていると知り、落とし前を付けようと考えたのだ。そんな中、おちかは偶然出会った夢次と親しくなり……。
江戸では、見知らぬ男女が話をする照蔵屋が大流行。大工の新八は、照蔵屋で知り合った商家の内儀と深い仲になり、彼女に乞われるままに両替商・備前屋の主人・清吉を襲撃。悲鳴を聞いて駆け付けた秀は、ノミで胸をひと突きにされた清吉を発見するのだった。
後藤備前守は、庶民の暮らしを第一に考える清廉潔白な大老。その備前守が、何者かによって拉致されてしまう。備前守に大恩のある朝右衛門は、これを知って主水らに助力を要請。お歌と秀は承知するが、主水は権力争いに巻き込まれるのを嫌って降りてしまう。
主水の釣り仲間・片山惣十郎は、貧しいながらも自らの道場を構える剣の達人。材木問屋・上州屋は、その道場を買いたいと頼み込むが、頑固な片山は大金を積まれても首を縦に振ろうとしない。上州屋は近隣の土地を手に入れ、抜け荷で儲けようと企んでいたのだ。
秀は、さだに紹介された美人絵師・千菊に「貴方の姿を絵にしたい」と頼み込まれる。裏の仕事のためにも極力人目を避けたい秀だが、千菊の絵に対する情熱に負けて、承諾することに。そんな中、千菊の絵の師匠・早雲が何者かによって惨殺されてしまう。
上方の元締からの仕事の依頼を請け、主水・秀・お歌は一路京へ。京の旅籠に落ち着いた秀は、健気に働く娘・お里と親しくなる。そんな中、同じく京へ辿り着いた京都所司代の次期候補・松倉は、町で偶然お里の顔を見かけて十年前の己が悪事を思い出すのだった。
最近お歌は、主水の幼馴染で瓦版屋の誠三郎に夢中。そんな中、瓦版屋の文蔵が何者かに斬殺される事件が発生する。誠三郎と仲間の矢源太、そして文蔵は、近々行われる貨幣改鋳で私腹を肥やそうとする者たちの密談を聞き、その悪事を告発しようとしていたのだ。
江戸の街では、夜中に出歩く若い娘が陵辱されて殺される事件が立て続けに起こっていた。今日も、お佐代（町田マリー）という娘が死体で見つかった。
江戸の河原に辻斬りが現われ、街は騒然となる。一方、南町奉行所では、江戸随一と言われる剣術師範の笠原監物（目黒祐樹）と息子・太平（浜田学）を招いて、指南を受けることになった。剣術の稽古と聞いて、見廻り同心・渡辺小五郎（東山紀之）や自身番の中村主水（藤田まこと）は憂鬱な気分に。
江戸の街で絵師の男が殺され、持ち物から枕絵が見つかった。事件そっちのけで絵の出来栄えに感心する見廻り同心・渡辺小五郎（東山紀之）。一方、経師屋の涼次（松岡昌宏）はなぜか、珍しく羽振りの良い毎日を送っている様子だ。
大河原伝七（福士誠治）は、同心の杉内久左衛門（石倉三郎）らとともに、阿片が取引されているという船着場を調べるが、旗本の望月十郎(梨本謙次郎)の船を取り調べたせいで、筆頭同心の坂本勘助（宇梶剛士）から蔵の整理役を命じられてしまう。
元旦の奉行所 留守居役を買って出た中村主水は、きままな正月を送ろうとするが、痺れ薬が仕込まれた差し入れの酒と料理で昏倒し、かどわかされる。目を覚ました主水は謎の男 市三より1,000両の報酬で、御三家の筆頭家老と堂島のコメ問屋 室田屋利兵衛の暗殺を依頼される。断ろうとする主水であったが断れば、裏の仕事をバラすと脅され、引き受けざるをえなくなる。
必殺シリーズ10周年記念と銘打って、棺桶の錠、知らぬ顔の半兵衛、仕掛の天平などの名立たる殺し屋たちが登場し、各々の殺しのシーンでは過去シリーズで、お馴染みのBGMが挿入されるといった、ファン サービス的な作品である。オランダ商館の一行が江戸に到着したその日、抜け荷検めの船手同心が殺され、また、江戸で唯一オランダ品を商う大店・江戸屋が襲われて一人残らず惨殺された。いずれも人間の仕業とは思われない酷い手口であった。程なくして仕事人・伊八が元締・鹿蔵の許へ、病気の妻のために鹿蔵が工面してくれた金を返しに現れる。まとまった金が手に入ったと言う伊八を鹿蔵は江戸屋の件で疑うが、伊八は仕事の仔細を鹿蔵に打ち明け釈明する。
生命保険会社「昭和生命」の訪問勧誘員・中村主水（藤田まこと）、手作りアクセサリーを路上で売る青年・村上秀夫（三田村邦彦）、ピアノ調律師・山田勇次（中条きよし）、個人タクシー運転手・長谷川加代（鮎川いずみ）の4人は、ごく普通のカラオケ仲間。しかし、彼らの先祖は、それぞれ仕事人として暗躍した中村主水、飾り職人の秀、三味線屋の勇次、何でも屋の加代であった。ある日の夜、カラオケ店に居合わせた悪人と争いになり、四人は袋叩きにあうが、衝動的に先祖同様、4人で組んで、殺しを行おうとする。
香港に住む劉孟春は日本人を母に持つ清国（現在の中国）の貿易商の娘。平和な日々を送っていたが英国と清国の悪徳貿易商人との癒着のアヘン密輸事件に巻き込まれる。父母を殺され、自身も失明した孟春は、母の遺言を受けて晴らせぬ恨みを晴らしてくれる仕事人を求めて来日する。彼女を追ってアヘン密輸商の面々も日本に向かう。孟春は清国の舞芸団（自称で実際は日本人）に身を隠していたがアヘン密輸商の武装団に発見されてしまう。偶々、舞台鑑賞に来ていた秀（三田村邦彦）に助けられ、自分が仕事人であることを伏せて依頼の筋を孟春から聞く。
下総（現在の千葉県）に巣食うヤクザの抗争に巻き込まれた百姓一家のお松（樹木希林）は母を殺され娘お鹿と共に仕事人に頼んで恨みを晴らそうと江戸にやって来る。この親子と縁があったおりく（山田五十鈴）は、主水（藤田まこと）と加代（鮎川いずみ）に助勢を求める。様子を覗っていた組紐屋の竜（京本政樹）、花屋の政（村上弘明）は主水達に猜疑心を持っていたが今回のみチームを組むことを承諾。しかし、依頼人であるお松一家はお鹿、夫、息子も全てヤクザの親分である笹川の繁蔵の刺客により殺されてしまう。
元禄14年（1701年）、江戸城・松之大廊下で起きた刃傷事件は、吉良上野介にお咎めなし、浅野内匠頭は即日切腹と決した。これにより処罰が喧嘩両成敗とは相成らず、浅野家急進派らによる吉良上野介への仇討ちが、江戸城内外で噂された。ことの成り行きを見守る市井の人々の中に、主水（藤田まこと）ら仕事人たちもいた。
時は幕末、日本はアメリカの圧力で開国し、領事館を置いた。そして、総領事・ハリスを慰労する目的で日米対抗ベースボール大会が開催されることが決定する。中村主水（藤田まこと）は、その大会の日本側監督として選ばれ、参加する選手を募る。一方、アメリカとの自由貿易開始による損失を恐れた御用商人達は、加代（鮎川いずみ）率いる仕事人「絵日傘」の一味を雇い、ハリスの暗殺を依頼する。
撮影中の藤田まことが事故で気絶している中、彼の夢の中で展開される物語/必殺スペシャル撮影中、藤田まことが屋根から転落し気が付くと本当の江戸時代にいた。そして藤田まことは本物の中村主水になっていた。地上げに絡む悪徳商人や役人を「必殺」する。
悪行の限りを尽くし私腹を肥やす悪僧・清海（綿引勝彦）。「親が死んだら貸した金を倍にして返す」という借用書を書かせ、その後配下の僧を向かわせ親を殺すという、悪辣非道の手段をも使っていた。神事である競べ馬（くらべうま）も賭け事にして大金を手にした清海だが、清海の仲間である依頼人に頼まれた主水（藤田まこと）ら仕事人グループが立ち上がる。
新年、上野東照宮を訪れた大奥年寄の春日野に甲賀忍者が襲いかかる。しかし、大半は春日野が連れてきた根来流忍者（雑賀衆）に返り討ちにされ、警備に借り出されていた中村主水（藤田まこと）も、そのうちの1人を斬り伏せる。死に際、彼は裏切られたという言葉を主水に残す。
京都所司代に出向中の北町奉行所同心・片山は、京都御所の改修工事にまつわる不正を暴き、幕府に直訴するため江戸に戻るが、何者かに襲われる。政（村上弘明）は彼を助けるが、結局は彼と彼の妻も殺害されてしまう。片山の無念を酌んだ政は、加代（鮎川いずみ）と共に京へと向かう。一方、中村主水（藤田まこと）も京都所司代への出張が決まり、上司・田中と江戸を発つ。
次期大老職を巡って老中の脇坂常陸守と石倉甲斐守は政治抗争を続けていた。石倉は金を使って他の老中や御三家といった有力者に根回しを行い、清廉な脇坂は石倉の不正を暴くべく奮闘していた。その頃、中村主水（藤田まこと）は佐渡の役人時代の初恋の女性・佐和（池内淳子）と再会する。2人は相思相愛の仲であったものの、彼女は奉行の娘であり、身分違いから別れた過去があった。
幕末、動乱の時代。攘夷浪士の乱行など荒れる世情から闇の会が解散し、仕事人達は仕事を失う。さらに主水（藤田まこと）は浪士隊の長・清河八郎（滝田栄）の内偵のため、表向き奉行所をクビになり浪士隊に入る。そこで清河は主水を気に入り、彼に極秘の仕事を与える。それは横浜の外国人商人の屋敷、通称モリソン館からペーパー（書類）を盗み出すというものであった。
中村主水（藤田まこと）は風呂屋でくつろいでいる際に十手を盗まれるという失態をおかす。天文台の警護をしつつ、十手を盗んだ犯人を捜す主水であったが、盗んだ十手を悪用していた犯人は何者かに殺害され、十手は見つからない。結局、十手を紛失したことが上司の鬼塚にばれ、閉門蟄居を命じられてしまう。一方、闇の会では、オランダ商館医・シーボルトが標的として競りにかけられる。
時は天保年間。老中・水野忠邦によって天保の改革が断行され、その腹心である鳥居耀蔵、通称「蝮の耀蔵」が南町奉行の任に就く。切れ者の鳥居は、倹約令などの徹底的な施行を厳命し、執拗な仕事人狩りを始める。そんな中、「闇の会」の依頼を競り落とした加代（鮎川いずみ）は仲間を集めようとするが、主水（藤田まこと）は鳥居の怖さを理由に断り、鶴（笑福亭鶴瓶）も別の大口の仕事を理由に断る。
主水（藤田まこと）と秀（三田村邦彦）は長崎で、混血女性セシリアからマカオの独裁者ディアロの殺しを依頼される。主水がマカオまで向かうことを躊躇しているうちに敵の来襲を受け、セシリアは連れ去られてしまった。そして150年後、主水の子孫・中村誠は、香港・マカオ3泊4日のパックツアーで、本業の添乗員をしていた。ツアー客の中には“せん”と“りつ”の他に、秀の子孫・田村秀夫も参加していた。ツアー中の誠・秀夫は謎の女性によって教会に導かれ、意識がタイムスリップしてしまう。タイムスリップ先は150年前のマカオだった。
初詣の帰り、"せん"と"りつ"が誘拐され、中村主水（藤田まこと）の元に老中・脇坂美濃守の殺害を命じる脅迫状が届く。一方、主水と旧知の仕事人である丑寅の辰（山城新伍）は、老中・綾部越中守が若い男女3人組の仕事人達に襲われている場面に出くわす。綾部は難を逃れるが、この話を聞いた主水は脇坂と綾部を狙う人物は同一と考え、お涼や辰の手を借りて黒幕を調べ始める。
必殺シリーズのスペシャルドラマで、前作『必殺仕事人2016』の続編。また『必殺仕事人2007』からのシリーズ復活10周年作品である。放送時期が早い段階で決まらなかったことから、タイトルに西暦表記がない。